Após 25 dias de incubação estática a 28 °C, a lacase de *Pleurotus ostreatus* NRC620 apresentou a maior atividade no meio de cultura fúngica. Os valores ótimos de pH e temperatura para essa enzima foram 3,0 e 70 °C, respectivamente. Após 2 horas de incubação a 40 °C e 50 °C, a atividade enzimática foi retida em 68,33% e 59,61%, respectivamente. Após 2 horas de incubação em tampão citrato-fosfato (pH 7,0), a atividade enzimática permaneceu em 100%. A adição de 10 mM de MgSO₄ e CuSO₄ aumentou a atividade enzimática em aproximadamente 21% e 35%, respectivamente, enquanto NaCl, MnCl₂, KCl e CaCl₂ inibiram a atividade enzimática. Utilizando ABTS como substrato, os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) da lacase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 foram de 1,99 mM e 16.217 μmol min−1 L−1, respectivamente. O tratamento enzimático de amostras de suco de maçã reduziu significativamente tanto o pH quanto a viscosidade, e essa redução correlacionou-se com um aumento no tempo de armazenamento. O tratamento com lacase resultou em uma leve diminuição no teor total de fenólicos do suco de maçã, mas nenhuma redução na atividade antioxidante foi observada.
Nos últimos anos, os pesquisadores têm se concentrado na aplicação da biotecnologia verde na indústria alimentícia. A lacase é uma das enzimas mais úteis nesse setor, encontrando aplicações em áreas como processamento de sucos, panificação, estabilização de vinhos e melhoria das qualidades organolépticas dos produtos alimentícios.1Muitas plantas superiores e microrganismos secretam lacase.2E fungos como deuteromicetos, ascomicetos e basidiomicetos também podem produzir lacase.3A lacase (EC 1.10.3.2) é uma oxidase azul que reduz o oxigênio molecular a água utilizando um sistema composto por três átomos de cobre diferentes, oxidando assim diversos compostos fenólicos e aminas aromáticas. Durante a produção de sucos de frutas e vegetais, o escurecimento enzimático e não enzimático são questões críticas.4Como essas substâncias afetam negativamente a cor, o sabor e o aroma do suco, elas devem ser removidas.5
De todas as frutas, a maçã é a mais consumida no mundo e na União Europeia. Em 2019, a produção de maçãs ocupou o terceiro lugar global, ultrapassando 87 milhões de toneladas.6As maçãs contêm numerosos compostos fenólicos, incluindo flavonoides e ácidos fenólicos como o ácido cafeico e o ácido clorogênico.7Como o suco de maçã é normalmente consumido em sua forma transparente, aproximadamente 50% a 90% dos componentes fenólicos são perdidos durante o processo de filtração.8Atualmente, os consumidores tendem a optar por produtos minimamente processados, como o suco de maçã turvo com alto teor de polifenóis. No entanto, devido ao seu alto teor de compostos fenólicos, esse tipo de suco de maçã é particularmente suscetível à descoloração e ao escurecimento.9Diversas tecnologias, incluindo métodos de tratamento térmico como a pasteurização a 60–90°C, são utilizadas para reduzir ou prevenir o escurecimento do suco de maçã.10Porém, segundo pesquisa de Sauceda-Gálvez11O processamento térmico pode destruir substâncias químicas voláteis e afetar as qualidades organolépticas do suco de maçã. Alternativas aos métodos de processamento térmico incluem dióxido de carbono supercrítico, radiação ultravioleta, ultrassom, alta pressão hidrostática ou homogeneização de alta pressão.12A eficiência dessas tecnologias e o rendimento de sucos de frutas adequados dependem dos parâmetros utilizados e das características do produto. Seu uso em larga escala é limitado pelos altos custos, pelos efeitos adversos na qualidade de alguns produtos alimentícios ou pela inativação inadequada das enzimas.13,14
A lacase pode ser usada para estabilizar e clarificar suco de frutas.15Gökmen e outros.16Recomenda-se o uso de lacase para clarificação de suco de frutas, pois ela remove eficazmente os compostos fenólicos, convertendo-os em polímeros ou oligômeros que são facilmente removidos por qualquer membrana de ultrafiltração, permitindo que o suco de maçã mantenha cor e transparência estáveis por até seis semanas a 50 °C. A lacase purificada de *Trichoderma* foi imobilizada em esferas de alumina e utilizada para remover seletivamente compostos que conferem sabor indesejável, causados pela contaminação microbiana do suco de maçã.17
Aproximadamente 80 a 90% dos componentes voláteis do suco de maçã são ésteres e aldeídos, que conferem um aroma único ao suco.18A lacase de *Trametes versicolor* foi imobilizada em um suporte de baixo custo feito de fibra natural de cascas de coco jovens para clarificação de suco de maçã.19Estudos anteriores investigaram a estabilização do suco de maçã (cor e turbidez) usando métodos sem enzimas ou com imobilização, ou em combinação com ultrafiltração.5,19No entanto, o efeito das lacases fúngicas nas propriedades físico-químicas do suco de maçã durante o armazenamento permanece incerto. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar experimentalmente as alterações nas propriedades físico-químicas, no teor de compostos fenólicos e na atividade antioxidante do suco de maçã após tratamento com lacases fúngicas e duas semanas de armazenamento refrigerado. As lacases têm a capacidade de oxidar compostos fenólicos, o que as torna promissoras para uso em diversos processos industriais, incluindo a clarificação de sucos. Este estudo examinou lacases de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, com foco nas condições ideais para sua atividade e eficácia na clarificação de sucos. Embora a pesquisa sobre cogumelos ostra (P. ostreatus NRC 620) ainda seja limitada, estudos anteriores examinaram enzimas de diversas fontes fúngicas, como Trametes versicolor e Ganoderma lucidum. O objetivo deste estudo foi avaliar a aplicação potencial dessa enzima na indústria alimentícia e destacar suas propriedades únicas, particularmente seu pH e temperatura ideais.
O ácido 2,2′-azooxibis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS) foi adquirido da Sigma-Aldrich (Canadá). Todos os outros reagentes eram de grau analítico.
O Centro de Coleção de Culturas Microbianas do Centro Nacional de Pesquisa obteve a cepa conhecida de cogumelo ostra NRC620. Após subcultura, esta cepa foi armazenada em tubos de ágar dextrose de batata a 4°C. O método de preparação do inóculo foi o seguinte: micélio totalmente desenvolvido, com 10 dias de idade, foi inoculado em placas de ágar dextrose de batata e incubado a 28°C. Após 10 dias, três blocos de micélio com 12 mm de diâmetro foram removidos do meio de ágar utilizando um perfurador de metal estéril e colocados em frascos Erlenmeyer de 250 mL com tampões de algodão contendo 50 mL de meio de cultura esterilizado (pH 5,0, conforme descrito anteriormente por Othman et al.).20As culturas foram incubadas a 28°C durante 18 dias. Em seguida, foram filtradas através de papel de filtro Whatman nº 1, e o sobrenadante resultante serviu como fonte de enzima.
A atividade da lacase foi determinada usando ABTS como substrato. A mistura de reação (2 mL) continha 500 μL de ABTS 0,3 mM (dissolvido em tampão citrato de sódio 0,1 M, pH 4,5) e a quantidade necessária de amostra da enzima diluída em água destilada.21,22Considerando que a lacase pode oxidar o ABTS à temperatura ambiente (28 °C ± 2), a oxidação do ABTS foi determinada medindo-se o aumento da absorbância a 420 nm (ε).420= 36.000 cm-1 M -1) usando um espectrofotômetro UV Agilent Cary-100. Uma unidade de atividade de lacase foi necessária para oxidar 1 μmol de ABTS por minuto. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford, usando albumina de soro bovino como controle interno.23,24
Após a obtenção da enzima da cepa de cogumelo ostra NRC 620, sua atividade foi medida em diferentes intervalos de cultivo durante 25 dias em condições estáticas a 28 °C.
Para estudar o efeito da temperatura na atividade da lacase, experimentos foram conduzidos na faixa de temperatura de 20 a 90 °C. Antes da adição da enzima e do início da reação, o tampão (citrato de sódio 0,1 M, pH 4,5) e o substrato (ABTS) foram misturados e incubados por 5 minutos em diferentes temperaturas. A estabilidade térmica da enzima foi avaliada por incubação em tampão fosfato de sódio 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 e 70 °C por 2 horas, respectivamente. A atividade residual foi então avaliada utilizando o substrato ABTS.
O efeito do pH na atividade da lacase foi avaliado utilizando ABTS como substrato em tampões citrato-fosfato 0,1 M com pH variando de 2,5 a 7,0. A solução enzimática foi incubada a 40 °C por duas horas em tampões citrato e Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 e 7) para avaliar a estabilidade do pH. A atividade residual com ABTS como substrato foi calculada após a incubação.
A lacase foi incubada por 10 minutos em tampão fosfato de sódio (0,05 M, pH 7,0) contendo vários íons metálicos (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ e Mn2+) nas concentrações de 2,5 mM e 10 mM, respectivamente. O substrato (ABTS) foi então adicionado para iniciar a reação, e a atividade relativa foi avaliada.
A oxidação do ABTS pela lacase em várias concentrações (0,025–3 mM) foi medida em pH 4,5 para determinar os parâmetros cinéticos (Vmax e Km). A cinéticaconstantesOs valores da equação de Michaelis-Menten foram calculados usando um gráfico de Lineweaver-Burk, que representa o inverso da velocidade da reação em função da concentração do substrato. As constantes cinéticas foram calculadas a partir do gráfico de Lineweaver-Burk usando o software GraphPad Prism versão 6.01.
Após lavar bem as maçãs com água da torneira, elas foram cortadas ao meio e o suco foi extraído utilizando um espremedor de maçãs Braun MP80 totalmente automático (fabricado na Alemanha). O suco foi filtrado através de quatro camadas de gaze. Nenhuma enzima foi adicionada ao grupo controle, enquanto 2,0% de lacase (a concentração mais eficaz testada) foi adicionada ao suco de maçã recém-preparado, que foi então armazenado a 4°C por duas semanas.
A acidez titulável (AT) e o pH foram determinados de acordo com o método de Boulton et al.al.27O pH de cada amostra foi medido utilizando um medidor de pH digital (medidor de pH JENWAY 3510). A acidez titulável (AT) foi calculada com base no ácido málico utilizando a seguinte fórmula.
Onde V e C são o volume (mL) e a concentração (0,1 mol/L) da solução de hidróxido de sódio usada na titulação, respectivamente. K é o coeficiente de conversão do ácido málico, igual a 0,067, e W é a massa (g) do suco de maçã.
Os sólidos solúveis totais (TDSO teor de glicemia de todas as amostras de suco foi determinado utilizando um refratômetro de bolso PAL-1 (ATAGO, Tóquio, Japão). Após cada medição, a lente óptica foi enxaguada com água deionizada e cada amostra de suco de maçã foi testada três vezes. O valor para cada amostra foi calculado pela média das três medições. A média ± desvio padrão para cada amostra de suco de maçã também foi calculada pela média desses resultados.
A viscoelasticidade das amostras de suco de maçã foi avaliada utilizando um viscosímetro rotacional (RV, Rheotest 2, Alemanha). A amostra foi colocada dentro do cilindro “S2” do viscosímetro. A viscosidade aparente foi representada pela inclinação da curva de tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento, que foi calculada a partir da tensão de cisalhamento e das curvas correspondentes em várias taxas de cisalhamento (de 1,00 a 437,4 s⁻¹). A fórmula para calcular a viscosidade aparente é a seguinte:
Onde η é a viscosidade aparente (cP), τ é a tensão de cisalhamento (dyn/cm²), γ é a taxa de cisalhamento (s⁻¹), e (τ) é calculado usando os valores de torque (α) e cilindro (Z) usando a seguinte fórmula: τ = Z . α.
O índice de escurecimento foi determinado de acordo com o método de Meidav et al.al.29Uma amostra de 10 ml de suco foi centrifugada a 2750 xg por 10 minutos. 5 ml do sobrenadante do suco foram misturados com 5 ml de etanol a 95%. A absorbância da mistura foi medida a 420 nm usando um espectrofotômetro UV Shimadzu (UV-1601 PC).
O teor total de fenólicos (TPC) foi determinado colorimetricamente usando o reagente de Folin-Ciocalteu, conforme descrito por Boulton et al.[27Uma curva padrão de ácido gálico foi construída para concentrações de 0 a 500 mg/L (r²= 0,997). Os resultados são expressos em equivalentes de ácido gálico (mg GAE/mL).
Adicione 125 μL de água destilada e 2850 μL de solução FRAP a 25 μL de suco de maçã e deixe a mistura no escuro por30min. Em seguida, meça a absorbância a 593 nm usando um espectrofotômetro UV Shimadzu (UV-1601 PC). O reagente FRAP foi preparado misturando tampão acetato 300 mM (pH 3,6), cloreto de ferro(III) 20 mM e 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) 10 mM (dissolvido em HCl 40 mM) na proporção de 10:1:1. Uma curva padrão foi gerada usando Trolox como padrão (R²= 0,999), e os resultados são expressos em μM Trolox/mL.
A atividade antioxidante dos sucos tratados e não tratados foi determinada utilizando o método DPPH para avaliar sua capacidade de eliminar radicais livres DPPH.31Dez microlitros de suco foram misturados com 1 ml de uma solução de DPPH (100 μM) em metanol. Após reação no escuro por 30 min, a absorbância da mistura foi medida a 517 nm usando um espectrofotômetro UV Shimadzu (UV-1601 PC). Os resultados foram expressos em equivalentes de Trolox (μM Trolox/ml) com base em uma curva de calibração (R2= 0,990).
Os dados obtidos mostraram que a produção máxima de lacase foi observada em cogumelos ostra NRC 620 ao final do 18º dia de fermentação, atingindo uma atividade de 1302 U/L. Isso serviu de base para determinar o tempo de cultivo ideal para a produção de lacase (Figura 1). Embora a produção da enzima tenha aumentado com o aumento do tempo de cultivo, a taxa de aumento não foi diretamente proporcional ao tempo de cultivo; após 21 dias, a atividade enzimática havia aumentado apenas 90 U/L (para 1390 U/L). Portanto, 18 dias foi finalmente selecionado como o tempo de cultivo ideal para equilibrar o rendimento do produto com os benefícios econômicos do aumento do tempo de cultivo.
Efeito do tempo de cultivo no rendimento de lacase em Pleurotus ostreatus NRC 620. Três blocos de micélio fúngico (12 mm) foram inoculados em 50 ml de meio estéril e cultivados a 28 °C por diferentes períodos de tempo.
Em consonância com outros estudos, nossos resultados indicam que o período ideal de cultivo para atingir o pico de secreção de lacase pelos fungos provavelmente situa-se entre 7 e 36 dias.32De acordo com Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 produziu a maior quantidade de lacase ao final do nono dia de fermentação, com uma atividade específica de 1637 U/mg de proteína. Além disso, Othman et al.34Constatou-se que *Trichoderma harzianum* S7113 secretou uma grande quantidade de lacase no quinto dia de cultivo. A taxa de produção de lacase atingiu um pico de atividade no décimo quarto dia e, em seguida, diminuiu gradualmente.34Embora a secreção de enzimas também possa ocorrer durante a fase principal de crescimento, ela geralmente atinge o pico durante a fase intermediária e é desencadeada pelo consumo de uma fonte de carbono ou nitrogênio.34,35
Embora a lacase de Pleurotus ostreatus NRC 620 tenha apresentado alta atividade em uma ampla faixa de temperatura, de 50 °C a 80 °C, aproximando-se do pico de atividade (69–98%), sua atividade máxima foi observada a 70 °C (Fig. 2a). Fora dessa faixa de temperatura, a atividade enzimática diminuiu em aproximadamente 70 °C. Esses resultados sugerem que a enzima é ativa em altas temperaturas, provavelmente porque a alta temperatura aumenta a energia cinética da reação.
Efeito da temperatura de reação (a) e do pH (b) na atividade da lacase em *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturas variando de 20 a 90 °C foram obtidas pela pré-incubação da mistura em diferentes temperaturas por 5 min antes da adição da enzima e do início da reação. O efeito do pH na atividade da lacase foi avaliado utilizando ABTS como substrato em soluções contendo tampão citrato-fosfato 0,1 M em uma faixa de pH de 2,5 a 7,0.
De acordo com Ezike etal.33A temperatura ideal para a lacase *Trametes polyzona* WRF03 é de 55 °C, a mesma que para *Ganoderma lucidum*.lacase36e semelhante à temperatura ideal (50 °C) para *Trametes polyzona* KU-RNW02737lacase . Baldrian38Observa-se que, tal como acontece com outros sistemas enzimáticos de degradação da lignina, a faixa de temperatura ideal para a lacase situa-se entre 50 e 70 °C.
Os resultados mostraram que a enzima apresentou a maior atividade em pH 3,0, atingindo 94% de atividade em pH 3,5. No entanto, manteve-se ativa em uma ampla faixa de pH, de 2,5 a 7,0 (Figura 2b). Além disso, apresentou maior atividade em condições ácidas em comparação com condições neutras ou alcalinas. Sua atividade permaneceu em pelo menos 77% na faixa de pH de 2,5 a 4,5, mas atingiu apenas cerca de 38% em pH 7,0. O pH ótimo para a lacase de *Trametes polyzona* WRF03 foi 4,533, o mesmo que o pH das lacases de *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 e *Trametes hirsuta* 41. Entretanto, de acordo com o estudo de Chairin et al.42O pH ótimo para a lacase de *Polymorpha f. sp.* WR710-1 é 2,2, enquanto o pH ótimo para a lacase de *Polymorpha f. sp.* IBL-04 é 5,043. A ligação de ânions hidróxido (inibidor da lacase) aos átomos de cobre da lacase T2/T3 pode ser a razão para a diminuição da atividade da lacase em condições de pH neutro ou alcalino. Isso pode interromper a transferência interna de elétrons do centro T1 para o centro T2/T3, afetando assim a atividade da lacase.limitandoa atividade enzimática23,44
Ao incubar a enzima em diferentes temperaturas, verificou-se que tanto o tempo quanto a temperatura de incubação afetavam a estabilidade da enzima. Notavelmente, a lacase de *Trametes polyzona* NRC 620 apresentou maior estabilidade a 40 °C e 50 °C, retendo 68,33% e 59,61% de sua atividade inicial, respectivamente, após 120 minutos (Figura 3a). Em contraste, sob as mesmas condições (40 °C e 50 °C, 120 minutos), a lacase de *Trametes polyzona* WRF03 reteve 64,38% e 42,92% de sua atividade, respectivamente.33Ao contrário, o aumento do tempo e da temperatura de incubação diminuiu a estabilidade da lacase de *Trametes polyzona* NRC 620; após incubação a 60 °C e 70 °C por 60 minutos, sua atividade diminuiu para 39,24% e 1,72%, respectivamente (Figura 3a). De forma consistente com os resultados experimentais, a lacase de *Trametes polyzona* WRF03 apresentou maior estabilidade a 40 °C e 50 °C durante todo o processo de tratamento térmico.33Da mesma forma, Lueangjaroenkit etal.37e Chairin etal.42Relataram a estabilidade das lacases de Trametes polyzona KURNW027 e Trametes polyzona WR710-1 a 50 °C durante 1 hora, respectivamente. Como um biocatalisador útil aplicável em diversos campos biotecnológicos, a lacase deve apresentar boa estabilidade e desempenho em uma ampla faixa de temperatura.
Estabilidade termostática (a) e estabilidade ao pH (b) da lacase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620. A estabilidade termostática foi avaliada incubando-se a solução enzimática em tampão fosfato de sódio 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 e 70 °C por 2 h, respectivamente. A estabilidade ao pH foi avaliada incubando-se a solução enzimática em tampão citrato 0,1 M e tampão Tris (pH 3, 4, 6 e 7) a 40 °C por 2 h. A atividade residual foi calculada utilizando ABTS como substrato após a incubação.
Para determinar as condições ideais de uso e armazenamento da enzima, investigamos o efeito do pH na estabilidade da lacase. A exposição a diferentes valores de pH afetou significativamente a estabilidade da estrutura da proteína, influenciando, consequentemente, a estabilidade e a atividade da molécula da enzima. Os resultados mostraram que a enzima foi menos estável em condições ácidas, enquanto demonstrou melhor estabilidade em valores de pH mais elevados (regiões neutras e alcalinas). Em valores de pH de 7,0, 6,0, 4,0 e 3,0, as taxas de retenção da enzima após 120 minutos foram de aproximadamente 100%, 62,54%, 52,39% e 11,14%, respectivamente (Fig. 3b). A lacase *Strombus multisus* WRF03 apresentou maior estabilidade em valores de pH neutros (5,5–6,5) e menor estabilidade em valores de pH ácidos (abaixo de 4,0). Após 120 minutos em valores de pH de 5,5, 6,0 e 6,5, as taxas de retenção da enzima foram de aproximadamente 82%, 100% e 93%, respectivamente.33Khairin e outros.42observaram que a lacase de Trametes polyzona WR710-1 era estável na faixa de pH de 6,0 a 7,0, enquanto Sayed et al.45Os resultados mostraram que a lacase era mais estável em condições de pH neutro. No entanto, a lacase de Cerrena unicolor também apresentou estabilidade em condições alcalinas (pH 9,0).46As lacases estudadas apresentaram alta estabilidade em uma ampla faixa de pH. Essa pode ser uma característica importante para aplicações industriais.
Como alguns íons metálicos apresentam efeitos tanto estimulatórios quanto inibitórios sobre a atividade enzimática, seus efeitos sobre essa atividade devem ser considerados em aplicações industriais. Isso é crucial porque os íons metálicos são contaminantes ambientais comuns que podem afetar a estabilidade e a síntese de enzimas extracelulares.47Para investigar os efeitos de múltiplos íons metálicos na lacase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, realizamos experimentos correspondentes. Como mostrado na Figura 4, dependendo do tipo de metal utilizado, o aumento da concentração do íon metálico de 2,5 mM para 10 mM afetou negativamente a função da enzima. Por exemplo,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, eCu²⁺poderiam estimular e ativar a atividade enzimática, enquantoNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, eK⁺poderiam inibir a atividade da enzima. Na concentração de 10 mM, os íons Cu²⁺ e Mg²⁺ foram os ativadores mais potentes da atividade da lacase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, proporcionando um grau de ativação de aproximadamente 34% e 20%, respectivamente. No entanto, na concentração de 10 mM, os íons Ca²⁺ foram os inibidores mais potentes da lacase, reduzindo a atividade da enzima em aproximadamente 60%.
Efeito de íons metálicos na atividade da lacase de Pleurotus ostreatus NRC 620. A lacase foi incubada por 10 minutos em tampão fosfato de sódio (0,05 M, pH 7,0) contendo diversos íons metálicos em concentrações de 2,5 mM e 10 mM. A reação foi então iniciada pela adição do substrato (ABTS), após o que a atividade relativa foi medida.
Nossos resultados são consistentes com os de outros autores que descobriram que Mg²⁺ e Cu²⁺ aumentam a atividade de *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ descobriram que a lacase de *Xylaria* sp. é estimulada em certa medida por íons de cobre (Cu²⁺). Além disso, Foroutanfar et al.⁴⁹ e Si et al.⁵⁰ conduziram estudos semelhantes em lacases de *Paraconiothyrium variabile* e *Trametes pubescens*, respectivamente. O sítio de ligação de cobre do tipo II (T2) dessa enzima pode ser saturado com Cu²⁺ em uma determinada concentração, o que pode explicar a estimulação da atividade da lacase em concentrações mais elevadas de Cu²⁺³⁹. Como as lacases dos fungos da podridão branca são oxidases que contêm múltiplos átomos de cobre, os efeitos dos íons de cobre na atividade da lacase são diversos e variam de estimulatórios e inibitórios a neutros.⁵¹ Em contraste, Zhou et al.. [52]relatou queCu²⁺inibiu a atividade da lacase do cupim subterrâneo de Taiwan (Odontotermes formosanus). No entanto, as lacases de Cerena sp. HYB07[53]e Clitocybe maxima[54]não foram afetados pelos íons de cobre.
A especificidade do substrato foi representada por seus parâmetros cinéticos (Km e Vmax); quanto maior a afinidade de ligação do substrato à enzima, menor o valor de Km e maior a especificidade do substrato.3,21,55Os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) da lacase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 foram determinados utilizando o software GraphPad Prism 6.0, através da construção do gráfico de Lineweaver-Burk (Figura 5). Utilizando ABTS como substrato, os resultados foram 1,99 mM e 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,respectivamente. Elsayed et al.21Relataram que os valores de Km para a oxidação de ABTS foram de 0,1 mM e 0,064 mM, respectivamente, indicando uma alta afinidade das isoenzimas Lac A e Lac B pelo ABTS. Além disso, os valores de Vmax foram de 0,182 μmol.min⁻¹e 0,603 μmolmin⁻¹respectivamente. O valor de Km obtido foi menor que o de Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); além disso, seu valor de Vmax (1429 mmol min⁻¹) também foimais baixoao usar ABTS como substrato.33 Da mesma forma, os valores de Km das concentrações de lacase de Lentinus squarrosulus MR13 e Trametes sp. AH28-2 foram 0,0714 mM e 0,025 mM, respectivamente, e os valores de Vmax foram 0,0091 mM min−1 e 0,67 mM min−1 mg−1 (em relação ao ABTS), respectivamente.56,57
Investigou-se o efeito da concentração de ABTS na atividade da lacase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 e construiu-se um gráfico de Lineweaver-Burk do inverso da velocidade inicial da reação versus a concentração de ABTS. A reação de oxidação do ABTS com diferentes concentrações (0,025–3,0 mM) de lacase foi medida em pH 4,5 para determinar os parâmetros cinéticos (Vmax e Km). As constantes cinéticas de Michaelis-Menten foram calculadas utilizando o gráfico de Lineweaver-Burk do inverso da velocidade da reação versus a concentração do substrato. Os cálculos das constantes cinéticas foram realizados a partir do gráfico de Lineweaver-Burk utilizando o software GraphPad Prism 6.01.
As enzimas clarificantes tradicionais, como as pectinases, hidrolisam substâncias pécticas, reduzindo a viscosidade e a turbidez. Elas degradam eficazmente os polissacarídeos estruturais e são frequentemente usadas em combinação com outras enzimas, como celulases e hemicelulases, para melhorar o rendimento e a claridade. No entanto, as pectinases não atuam especificamente sobre os compostos fenólicos, que são os principais responsáveis pela turbidez e pelo escurecimento oxidativo, particularmente em sucos como o de maçã e o de uva.58Em contraste, as lacases catalisam a oxidação de compostos fenólicos, polimerizando-os em moléculas maiores e insolúveis que podem ser removidas por sedimentação ou filtração. Esse mecanismo não só melhora a claridade, como também prolonga a vida útil do suco, reduzindo a probabilidade de escurecimento oxidativo causado por compostos fenólicos. Além disso, os processos de clarificação baseados em lacase podem ser realizados em condições de processamento brandas (pH 3,5–5,5, temperatura 25–40 °C), tornando-os adequados para sucos delicados sem comprometer suas propriedades nutricionais ou organolépticas.59Estudos demonstraram que o tratamento com pectinase pode clarificar o suco em 1 a 2 horas, enquanto o tratamento com lacase normalmente requer um tempo de reação mais longo (3 a 6 horas) para reduzir completamente os compostos fenólicos. No entanto, esse processo pode ser otimizado pela imobilização da enzima ou pela combinação da lacase com métodos de clarificação mecânica.60Neste estudo, a análise enzimática do extrato bruto revelou atividades significativas de lacase e α-amilase, enquanto as atividades de pectinase e xilanase foram extremamente baixas e a atividade de celulase não foi detectada. Portanto, a redução na turbidez e no teor de fenólicos deveu-se principalmente à ação da lacase, enquanto a alteração na viscosidade pode ser parcialmente atribuída à ação da amilase.
A Tabela 1 mostra os parâmetros físico-químicos do suco de maçã fresco e das amostras tratadas com lacase. Os resultados mostraram que o rendimento do suco de maçã fresco (71,59%) foi menor do que o das amostras tratadas com lacase (87,34%). Esses resultados são consistentes com as descobertas de Pilnik e Orange.61, que indicaram que o uso de enzimas no processamento de frutas pode aumentar o rendimento de suco, melhorar a filtração e obter suco límpido e de alta qualidade para concentração. O aumento no rendimento de suco deve-se principalmente ao aumento do teor de açúcares solúveis no suco. Durante a hidrólise enzimática das frutas, a mesogleia e a pectina nas paredes celulares do produto são destruídas e convertidas em substâncias solúveis, como açúcares neutros e ácidos.62.O valor do pH do suco de maçã tratado com enzima foi significativamente menor do que o do grupo controle (P < 0,05), e o valor do pH de ambos os grupos aumentou significativamente durante o armazenamento (Tabela 1). Esses resultados são consistentes com os de Mark et al.63, que observou que o pH do suco de caju diminuiu após o armazenamento subsequente ao tratamento térmico. A degradação da pectina e a formação de ácido galacturônico após o tratamento enzimático podem ser responsáveis pelo aumento do pH durante o armazenamento. O pH das amostras tratadas com enzimas permaneceu entre 4,05 e 4,31 durante todo o período de armazenamento, enquanto o pH do suco de maçã não tratado variou entre 4,12 e 4,33.
A acidez total (AT) das amostras, tanto não tratadas quanto tratadas com lacase, apresentou uma tendência decrescente com o aumento do tempo de armazenamento (Tabela 1). A diminuição da acidez foi atribuída à conversão de ácidos orgânicos em carboidratos ou a reações enzimáticas, bem como à oxidação durante o armazenamento do suco.64A acidez total do suco de maçã controle e das amostras tratadas com enzimas foi menor do que a de outros sucos (suco de morango 0,9%, suco de ameixa 2,2%, suco de kumquat 1,0%, suco de damasco 2,4%, suco de laranja 0,8%), mas semelhante à de outros sucos (por exemplo, suco de pera 0,3%).62Essas diferenças no suco de maçã fresco não tratado podem ser atribuídas a diversos fatores, como condições de cultivo, fatores genéticos, nível de maturação e métodos de processamento.65A diminuição da acidez total do suco de maçã controle e do suco de maçã tratado com lacase está de acordo com os resultados apresentados por Singh et al.66com relação à diminuição da acidez total do suco de maçã Jin Nuo após 74 dias de armazenamento. Por outro lado, Oshmiansky e Wojdylo67Não foram encontradas alterações significativas na acidez do suco de maçã ao estudar o efeito dos métodos tradicionais de clarificação.
Os resultados apresentados na Tabela 1 indicam que o valor de sólidos solúveis totais (SST) do suco de maçã tratado com lacase foi superior ao da amostra não tratada. Esses resultados são consistentes com estudos publicados.. 68Além disso, a Tabela 1 mostra que o valor de SST (Sólidos Solúveis Totais) do grupo controle de suco de maçã foi de 9,58 no ponto inicial e atingiu 11,05 ao final do período de armazenamento. Esses valores são inferiores aos valores de SST do suco de maçã fresco relatados por Hamid et al.. 69(11,2 e 11,80, respectivamente). O valor de SST das amostras de suco de maçã tratadas com lacase aumentou significativamente, partindo de 11,23 e atingindo 12,93 após duas semanas de armazenamento a 4 °C (Tabela 1). Um aumento semelhante no SST durante o armazenamento também foi observado em frutas cítricas, limões e laranjas doces. O aumento nos sólidos solúveis totais (SST) durante o armazenamento pode ser devido à hidrólise de polissacarídeos (amido) em monossacarídeos (açúcares), ao aumento da concentração devido à desidratação do suco e à degradação da pectina no suco em sólidos solúveis. O aumento nos sólidos solúveis totais (SST) provavelmente se deve ao aumento nos açúcares solúveis, que podem ser formados pela conversão de pectina ou celulose em açúcares solúveis pela pectina ou celulase, respectivamente, ou pela hidrólise do amido em açúcares, conforme relatado por Hamed et al.69.O efeito da lacase nas propriedades do suco de maçã pode ser observado visualmente, visto que o suco tratado com lacase apresenta melhor fluidez e menor viscosidade do que o suco não tratado. Essa observação está registrada na Tabela 1; a viscosidade da amostra tratada com a enzima foi de 1,87 cP, enquanto a viscosidade da amostra controle foi de 2,95 cP. Essa diminuição significativa na viscosidade provavelmente se deve à maior capacidade de retenção de água das substâncias semelhantes à pectina e à formação de uma estrutura de rede coesa.
Neste estudo, o efeito da lacase no índice de escurecimento (IE) do suco de maçã foi investigado medindo-se a absorbância a 420 nm utilizando um espectrofotômetro. Os resultados são apresentados na Tabela 1. Durante o armazenamento, o IE das amostras de suco de maçã, tanto nos grupos tratados quanto nos não tratados, apresentou uma tendência de aumento gradual. O IE reflete o grau de escurecimento e pode servir como indicador de temperatura de cor.um importanteindicador de reações de escurecimento enzimático e não enzimático. A absorbância aumentou significativamente durante o armazenamento (P < 0,05). Ao final do armazenamento, oA420O valor das amostras de suco de maçã nos grupos controle e tratados com enzima aumentou em cerca de 217% e 121%, respectivamente (Tabela 1). Os resultados indicam que o tratamento enzimático pode reduzir efetivamente o grau de escurecimento em cerca de 56%. Os resultados de Bezerra et al.[19] são consistentes com nossos resultados; Eles usaram lacase-glutaraldeído-fibra de coco para clarificar suco de maçã, reduzindo sua cor original em 61%.
Embora os polifenóis presentes nos sucos de frutas tenham efeitos nutricionais e terapêuticos positivos no corpo humano, eles também podem reagir com proteínas, causando turbidez, sedimentação ou alteração do sabor e aroma do produto, além de reduzir seu prazo de validade.71O objetivo deste estudo foi reduzir com segurança o teor de compostos fenólicos do suco de maçã utilizando lacase de Pleurotus ostreatus NRC 620. Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram que o teor total de compostos fenólicos do suco de maçã tratado com lacase foi significativamente reduzido antes do armazenamento a 4 °C. Além disso, o teor total de compostos fenólicos também diminuiu durante o armazenamento em ambas as amostras estudadas (Tabela 1). Pesquisa de Sandri et al.72mostraram que o suco de maçã tratado com enzimas pode reter sua atividade antioxidante e teor de compostos fenólicos. No entanto, os resultados de um estudo de Lettera et al.73mostram que o tratamento do suco de laranja com lacase fúngica pode reduzir o teor de compostos fenólicos em até 45%.
Foi demonstrado que os compostos fenólicos possuem propriedades como eliminação de radicais livres, redução e neutralização de oxigênio singlete, transferência de átomos de hidrogênio e doação de elétrons para radicais livres, tornando-os potentes antioxidantes.74Portanto, neste estudo, os métodos baseados em DPPH e FRAP foram utilizados para avaliar o efeito da lacase na atividade antioxidante do suco de maçã armazenado em refrigerador por 14 dias (Tabela 2). Ambos os métodos mostraram um aumento na atividade antioxidante durante o armazenamento, o que pode ser devido ao aumento de compostos fenólicos livres ou à formação de produtos da reação de Maillard (PRMs), sendo os produtos da reação de Maillard provavelmente a causa do aumento na atividade antioxidante.75Reações de escurecimento não enzimáticas (incluindo a degradação do ácido ascórbico, as reações de Maillard e a degradação de açúcares catalisada por ácido) produzem pigmentos marrons (melanoidinas). Produtos intermediários da degradação do ácido ascórbico e produtos da degradação de açúcares (como compostos carbonílicos) podem reagir com aminoácidos por meio de reações de Maillard.76Embora o escurecimento de frutas e vegetais durante o armazenamento tenha sido amplamente estudado, nossa compreensão dessas reações ainda é limitada.77Em comparação com o método FRAP, o suco de maçã tratado com lacase apresentou atividade antioxidante significativamente menor pelo método DPPH (Tabela 2), e a atividade antioxidante de todas as amostras aumentou significativamente com o aumento do tempo de armazenamento. Dois métodos diferentes para determinar a atividade antioxidante foram utilizados neste estudo devido aos seus princípios distintos. O método DPPH mede a capacidade de neutralizar radicais livres, enquanto o método FRAP mede a capacidade de reduzir íons de ferro. Portanto, recomenda-se o uso de múltiplos métodos para determinar a atividade antioxidante, a fim de melhor compreender a atividade antioxidante das amostras estudadas.78
Uma das principais descobertas deste estudo é que a lacase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 apresenta atividade ótima a 70°C e pH 3,0. Comparada a outras lacases fúngicas comumente utilizadas para clarificação de sucos, como as lacases de *Trametes versicolor* e *Ganoderma lucidum*, a *P. ostreatus* NRC 620 exibe maior estabilidade térmica e um pH mais ácido. As lacases de *Trametes versicolor* e *Ganoderma lucidum* tipicamente apresentam atividade ótima na faixa de 50-60°C e em valores de pH entre 3,5 e 5,0. Essa diferença pode contribuir para uma maior eficiência na clarificação de sucos, especialmente para sucos ácidos, onde a estabilidade em valores de pH mais baixos é crucial. A característica única da *P. ostreatus* NRC 620, em comparação com outras lacases fúngicas estudadas, é a capacidade de funcionar eficazmente em condições mais desafiadoras. A temperatura ótima de atividade mais elevada sugere vantagens potenciais em aplicações industriais, como taxas de reação mais rápidas e menor contaminação microbiana. Seu baixo pH, adequado à natureza ácida de muitos sucos, pode ser útil em processos de clarificação de sucos. Esses resultados justificam uma investigação mais aprofundada para aplicação em larga escala, tornando *Pleurotus ostreatus* NRC 620 uma alternativa viável às fontes tradicionais de lacase fúngica. Em comparação com estudos anteriores, descobrimos que a temperatura ótima é de 60 °C e o pH ótimo é 3,0. Após reação a 60 °C por 80 minutos, a lacase de *Ganoderma lucidum* manteve-se ativa.46% de sua atividade.79 De acordo com Kurniawati e Nicelle80As enzimas de *Ganoderma lucidum* exibem estabilidade excelente a moderada a 25 °C e valores de pH entre 5,0 e 8,0, e estabilidade a pH 6,0 e temperaturas entre 10 e 30 °C. Neste estudo, descobrimos que o pH e a temperatura ótimos para a atividade enzimática de *Pleurotus ostreatus* foram 3,0 e 70 °C, respectivamente. Após incubação a 40 °C e 50 °C por duas horas, a enzima reteve 68,33% e 59,61% de sua atividade, respectivamente. Além disso, a lacase NRC 620 de *Pleurotus ostreatus* exibiu alta atividade em uma ampla faixa de temperatura, de 50 °C a 80 °C, quase atingindo a atividade máxima (69%–98%), com atividade máxima observada a 70 °C.
Em conclusão, a lacase de cogumelo ostra NRC620, obtida em condições estáticas, demonstrou atividade e estabilidade ótimas em uma ampla faixa de pH e temperatura, apresentando estabilidade superior em comparação com outras fontes enzimáticas. A adição de 10 mM de MgSO₄ e CuSO₄ aumentou a atividade enzimática em aproximadamente 21% e 35%, respectivamente. Quando processada em suco de maçã, a enzima reduziu o pH e a viscosidade, enquanto o teor de compostos fenólicos diminuiu apenas ligeiramente durante o armazenamento.
Os resultados confirmam o potencial da lacase na indústria alimentícia, particularmente na clarificação de bebidas. Ao decompor especificamente os compostos fenólicos, a lacase não só reduz a turbidez e melhora a transparência, como também mantém a qualidade dos sucos de frutas em condições operacionais brandas. Diferentemente dos agentes clarificantes tradicionais, como gelatina, bentonita e sílica gel, a lacase não gera resíduos nem remove aromas agradáveis das bebidas, tornando-se uma opção mais ecológica e sustentável. Além disso, em comparação com outras enzimas e métodos de filtração, a lacase oferece uma solução direcionada e com boa relação custo-benefício, sem comprometer a qualidade do produto.
Kyomuhimbo, HD e Brink, HG. Aplicações e estratégias de imobilização de lacases contendo cobre; uma revisão. Heliyon 9, e13156 (2023).
Data de publicação: 15 de dezembro de 2025